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活性炭柱色谱大全

文章出处:e胜博官网 人气:发表时间:2021-01-19 09:56

  第三节 活性炭柱色谱 活性炭属于非极性吸附剂, 主要用于色素的脱除和水溶性成分如氨基酸、 糖类及某些水溶性较大的苷类的分离, 他是分离水溶性成分的主要方法之一。 活性炭柱色谱的特点是原料来源较易、 价格便宜、 载样量较大、 分离效果较好, 适合于大量制备分离。 但是由于活性炭的生产原料不同, 制备方法及规格各异, 其吸附力不像硅胶、 氧化铝那样易于控制。 到目前为止, 尚无测定其吸附力级别的理想方法, 限制了活性炭柱色谱的广泛应用。 一. 活性炭的来源及制备 活性炭按其来源通常分为植物碳、动物炭和矿物炭三种, 系分别采用木屑或植物性纤维、动物...

  第三节 活性炭柱色谱 活性炭属于非极性吸附剂, 主要用于色素的脱除和水溶性成分如氨基酸、 糖类及某些水溶性较大的苷类的分离, 他是分离水溶性成分的主要方法之一。 活性炭柱色谱的特点是原料来源较易、 价格便宜、 载样量较大、 分离效果较好, 适合于大量制备分离。 但是由于活性炭的生产原料不同, 制备方法及规格各异, 其吸附力不像硅胶、 氧化铝那样易于控制。 到目前为止, 尚无测定其吸附力级别的理想方法, 限制了活性炭柱色谱的广泛应用。 一. 活性炭的来源及制备 活性炭按其来源通常分为植物碳、动物炭和矿物炭三种, 系分别采用木屑或植物性纤维、动物的骨头、 煤屑等经高温炭化而成。 目前常用的药用活性炭及色谱用活性炭系多以木屑作原料, 加氯化锌在 700-800 经高温炭化、 活化, 并经适当方法处理除去杂质而成。 由于在植物体内含有各种金属离子及在生产过程中加入了氯化锌, 虽在出厂前经过了适当处理,但也难免含有微量金属离子, 用时应注意。 用于色谱的活性炭大致有以下三类。 (一). 粉末状活性炭 一般采用药用或化学纯活性炭。 这类活性炭颗粒极细, 呈粉末状, 其总表面积特别大,吸附力很强, 吸附量也很大, 是活性炭中吸附力最强的一类。 但是由于颗粒太细, 在色谱过程中流速太慢, 需要加压或减压操作, 手续较繁, 加之对各类成分的吸附选择性也较差, 故在色谱中较少使用。 药用或化学纯活性炭在出厂前都经过杂质处理和金属限量的检查, 可直接供色谱使用。工业用活性炭在出厂前未经过杂质处理, 往往含有金属离子, 影响分离效果, 故在使用前必须处理, 其处理方法两种。 具体方法如下: (1). 取工业用活性炭, 加 7%-10%盐酸(因工业用活性炭中的主要杂质是铁, 盐酸可与铁反应生成氯化铁, 故可用盐酸处理), 置水浴上在间歇搅拌下加热半小时, 减压滤干, 。如此以盐酸反复处理三次, 最后以热蒸馏水洗至 pH 5-6, 滤干, 置烘箱中在 105 C 干燥8 小时, 装瓶密塞, 备用。 (2). 将工业用活性炭置于三角瓶中, 用 20%醋酸水溶液煮沸 5-10 分钟, 减压蒸干(可除去活性炭中的含氮杂质及部分金属离子)。 如此反复处理二到三次, 在以热蒸馏水洗至 pH 5-6, 滤干。 将上述处理的活性炭悬浮于水中, 加入氰化钾(预防重金属离子的催化作用), 氰化钾与活性炭的用量比为 5:10000, 即每 1Kg 活性炭需加氰化钾 500mg, , 直火加热, 在 60 C 保持 10 分钟, 趁热过滤, 以热蒸馏水洗至 pH 6-7, 在烘箱中于 100 C 干燥至恒重, 置于瓶中密塞备用。 (二). 颗粒状活性炭 颗粒状活性炭的颗粒比粉末状活性炭要大, 其总表面积相应要小, 吸附力和吸附量也较次于粉末状活性炭。 但对天然药物成分的吸附选择性比较高, 在色谱过程中流速易于控制,无需加压或减压等操作, 基本上克服了粉末状活性炭的缺点。 (三). 锦纶-活性炭 这种活性炭是以锦纶为粘合剂, 将粉末状活性炭制成颗粒, 其总表面积较颗粒状活性炭要大, 较粉末状活性炭要小。 加入的锦纶不仅起到一种粘合剂的作用, 它也是一种脱活性剂。因此, 它的吸附力比前两类的活性炭都要弱, 但对成分的吸附选择性较高, 流速易于控制,操作简便。 该类活性炭适用于分离前两种活性炭吸附力太强而不易洗脱的化合物, 用其分离酸性氨基酸和碱性氨基酸, 可获得很好的效果。 锦纶-活性炭的制备方法: 取废锦纶(聚己内酰胺, 又称尼龙 6) 丝或工业锦纶聚合体,置于搪瓷桶内(桶应无破损), 加 10 倍量的工业用冰醋酸, 于通风橱内直火加热至 90 C(当心燃烧!), 不断搅拌, 使锦纶全部溶解。 在搅拌下加入药用活性碳或化学纯活性炭(与锦纶用量之比为 1:1), 搅拌后任其自然冷却, 并间歇的加以搅拌, 使锦纶均匀的析出在活性 炭上。 室温放置过夜, 减压过滤。 滤液回收醋酸, 滤渣用大量自来水水洗至 pH4-5, 再用蒸馏水洗至中性, 吸干。 于 100 C 干燥至适当温度, 通过纱窗用的塑料网, 制成颗粒。 再置烘箱中于 100 C 烘干成型, 将此颗粒加水浸泡, 搅拌除去气泡, 装入玻璃柱中, 用蒸馏水洗至中性。 倒出, 减压滤干, 于 100 C 干燥, 过筛(通过窗用塑料网) 备用。 二. 活性炭吸附力与结构的关系 活性炭为多孔性无定形粉末, 具有结晶的性质。 经 X-衍射分析, 活性炭的结构是由碳原子相互以共价键结合成六角形(表层除外), 并以两层或多层堆叠成平板状, 和石墨的晶格差不多, 只不过石墨的板块结合的比较紧密些。 活性炭对气体或对某些溶液的溶质有吸附作用, 有的被吸附在炭的表面, 有的被吸附在炭的结构内部。 其吸附力的大小与活性炭的总表面积有关, 碳的颗粒越细, 总表面积越大,吸附力越强, 反之亦然。 同一细度的活性炭, 其吸附力的强弱与被吸附物质的结构有关。 一般来讲, 凡是具有共轭双键结构的化合物, 活性炭都易吸附, 共轭双键越多, 活性炭对其吸附力就越大。 这主要是因为活性炭具有以共价键相互结合而成的六角形结构(具有芳环的大 键结构性质), 易与共轭双键发生相互作用。 一些色素类物质, 大多数具有共轭结构, 容易被吸附在炭上, 在重结晶过程中加活性炭脱色以除去杂质, 就是这个道理。 对同一骨架类化合物或同一类型类化合物, 引入胺基、 羟基、 羧基等极性基团, 往往会增加活性炭对它的吸附力。 活性炭对物质的吸附力除与被吸附物质的结构有关外, 还与所用溶剂有关。 通常在水中吸附力最强, 乙醇和丙酮次之, 在其它溶剂中较弱。 故加活性炭脱色时, 在水溶液中效果最好, 在乙醇和丙酮中次之, 在其他有机溶剂中几乎无脱色能力。 活性炭对溶液中溶质的吸附力的大小, 除与活性炭的粒度和被吸附物的结构有关外, 还须考虑溶质与溶剂的相互作用情况, 即还须考虑溶剂对溶质的溶解度的大小。 活性炭色谱常在水溶液中进行, 被吸附物在水中溶解度这个因素有时对吸附力或吸附稳定性可起到关键作用。 例如, 活性炭对碘的吸附力, 因碘在水中的溶解度最小, 故在水中活性炭对其吸附力最大。 又如活性炭对反式丁二烯酸的吸附力大于顺式丁二烯酸, 其原因就是反式丁二烯酸在水中的溶解度比顺式丁二烯酸小。 综上所述, 可将活性炭的吸附力与结构的关系归纳如下: 1. 对极性基团(如胺基、 羧基、 羟基等) 多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物。 如活性炭对酸性氨基酸和碱性氨基酸的吸附力大于中性氨基酸。 其原因就是酸性氨基酸中的羧基比中性氨基酸多, 碱性氨基酸中的氨基或其他碱性基团比中性氨基酸多。 因而, 可借此性质将酸性氨基酸或碱性氨基酸与中性氨基酸分开。 又如, 因羟基脯氨酸比脯氨酸多一个羟基, 故活性炭对羟基脯氨酸的吸附力大于脯氨酸; 2. 当极性基团相同时, 对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物。 因而当芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸的氨基和羧基数目相同时, 可借助活性炭色谱的方法将它们分开。 也可将某些水溶性芳香族化合物与脂肪族化合物分开; 3. 对分子量大的化合物的吸附力大于分子量小的化合物。 例如, 活性炭对肽的吸附力大于氨基酸, 对多糖的吸附力大于单糖。 因此可利用活性炭分离氨基酸与肽, 单糖与多糖。氨基酸、 单糖先被洗脱下来, 肽、 多糖后被洗脱下来。 三. 活性炭的选择 在三类活性炭中, 粉末状活性炭的吸附力最强, 颗粒状活性炭次之, 锦纶-活性炭最弱。这三类不同规格的活性炭, 类似于活性不同的一级、 二级和三级品。 在色谱分离时, 可根据所分离物质的特点, 选择适当吸附力活性的活性炭, 所选择活性炭的吸附力正确与否是分离能否成功的关键。 当欲分离的物质不易被活性炭吸附时, 则要选择吸附力强的活性炭。 当欲分离的物质很易被活性炭吸附时, 则要选择吸附力弱的活性炭。 在首次分离某种样品时, 通常首先选用第二种活性炭。 当发现该类活性碳对欲分离的物质因不能很好的吸附, 从而导致 分离失败时, 可改用第一种活性碳。 当发现该类活性碳对欲分离的物质因吸附力过强而不能洗脱, 或因很难洗脱而造成洗脱溶剂太大、 流分不集中时, 则可改用第三种活性炭。 有时可采用三种活性炭联合应用的方法以达到使较复杂的天然药物成分分离的目的。例如, 首先将欲分离的样品通过第三种活性炭柱, 对活性炭附着力最强的成分吸附在该柱上。不被吸附的物质再通过第二种活性炭, 附着力较弱的物质被吸附在第二根柱上, 不被吸附的物质最后再通过第一种活性碳。 这样依次通过三根柱, 在三根柱上被吸附的物质分别用适当的洗脱剂洗脱, 就可能极复杂的天然药物成分分别得到较好的分离。 因粉末状活性炭的颗粒极细, 操作不便, 故在实际应用过程中, 一般尽量不用第一种活性碳。 不用粉末状活性炭的另一个重要原因是粉末状活性炭的吸附力太强, 有许多物质吸附在上面极难洗脱, 通常是将吸附剂脱活后才使用。 四. 活性炭柱色谱的一般操作 (一). 活性炭的预处理 活性炭是一种强吸附剂, 对气体的吸附力和吸附量都很大。 当气体分子占据了活性炭的吸附表面时, 活性炭的吸附力就会降低, 造成了所谓的活性炭的“中毒”。 如果活性炭上吸附有氧气, 有时还会使被吸附的物质发生氧化反应。 故在使用活性炭之前, 必须除去被吸附的大部分气体。 通常除去活性炭中的气体有两种方法, 一种方法是用麻黄碱或硫化氢的饱和水溶液处理, 但这种处理方法过于繁杂, 而且通过这些处理也可引起另外一些副反应, 故不太常用。 另一种方法是加热烘干, 可将吸附的绝大多数气体除去。 一般是在使用前在 150 C 加热干燥 4-5 小时即可。 因锦纶受热温度高会变形, 故锦纶活性炭在使用前于 100 C加热干燥 4-5 小时即可。 活性炭对某些物质有不可逆的吸附作用, 致使某些物质吸附在上面无法洗脱。 故在分离易被活性炭吸附的物质时, 必须先对活性炭脱活。 活性炭脱活常用的试剂是长链脂肪族化合物, 如硬脂酸、 油酸、 十一烷酸、 十八烷、 十八烷胺等, 其中最常用的是硬脂酸。 其具体方法如下: 取活性炭置入适当的容器内, 用 1.5%的硬脂酸乙醇溶液浸没, 搅拌 1 小时后, 在搅拌下用 9 倍量的蒸馏水稀释, 减压滤干, 用蒸馏水洗三次, 滤干后空气干燥或真空干燥,备用。 (二). 装柱 因活性炭在水中的吸附力最强, 故通常是在水中装柱。现将活性炭用蒸馏水浸泡 1 小时,不断搅拌, 除去活性炭中的气泡。 在色谱管中先加入少量蒸馏水, 在以玻璃纤维塞住色谱管的底部, 并除去玻璃纤维中的气泡, 然后将除去气泡的活性炭倒入色谱管中, 让其自然沉降,装置所需体积, 备用。 粉末状活性炭因流速太慢, 须与硅藻土(1:1) 混合后, 在用蒸馏水调成糊状装柱。 待样品上柱后, 为解决流速太慢问题, 须在色谱管顶端连一个有自动控制的加压泵或在色谱管下端连一个减压泵, 以提高流速。 (三). 加样 因活性炭在水中吸附力最强, 多以水为溶剂上柱, 故样品多以水为溶剂溶解。 其浓度在25%-50%之间, 即 1 克样品可用 2ml-4ml水溶解。通常活性炭色谱的上样量较大, 每 100ml的活性炭可上 5g-10g 样品。 样品上样量和样品浓度可根据具体情况作适当调整。 例如, 当欲分离的物质在样品中的含量相对较低, 且活性炭对其吸附力较强, 而其它成分不易被吸附时, 则可加大样品的上样量。 使大部份其它成分能很快的从柱中流出来, 而欲分离的成分经过适当洗脱即可获得。 当欲分离的成分不止一个, 且均不易被活性炭吸附时, 则样品上样量必须大大降低, 才能达到分离的目的。 总之, 在上样量上要具体情况具体分析, 不能生搬硬套。 对于不能在水中溶解的样品, 可加入适量甲醇、 乙醇、 丙酮等溶剂使其溶解。 但样品体 积不可过大, 而且样品的上样量也应减少, 否则影响分离效果。 (四). 洗脱 洗脱溶剂通常采用水、 不同浓度的乙醇等。 也有采用丙酮水溶液、 2%-5%醋酸的水溶液、 1%-5%苯酚的水溶液、 7%-15%苯酚的乙醇溶液、 吡啶的水溶液等洗脱的, 但不常用。 最常用的是用水溶液和由稀到浓的乙醇水溶液梯度洗脱。 其洗脱力由弱到强的顺序是:水, 5%、 10%、 20%、 30%、 50%、 70%、 95%的乙醇溶液、 1%-5%苯酚的水溶液、 7%-15%苯酚的乙醇溶液、 吡啶的水溶液。 若仍有部分物质没有被洗脱下来, 可用适当有机溶剂或 3.5%的氨水溶液洗脱。 当一种溶剂的洗脱物很少时(蒸干后残渣很少), 可改用下一种溶剂。 各种洗脱液分部收集, 分别浓缩, 浓缩液用薄层色谱或纸色谱检查, 相同者合并。 使用过的活性炭可用酸、 碱处理回收, 锦纶-活性炭可按照锦纶的回收法回收。 因活性炭的来源易得, 价格低廉、 一般经使用后, 不做回收处理。 二. 活性炭柱色谱的操作实例 取美舌藻(Caloglossa leprieuii (Ment) j. Ag.)粗粉 25Kg, 用 70%乙醇加热回流三次, 每次1.5 小时。 浓缩提取液至 6000ml , 冷却, 通过 100 目筛除去叶绿素树脂状物。 加石灰乳沉淀, 滤取沉淀(内含海人草酸钙), 悬浮于水中, 加半量乙醇, 搅拌放置后, 用 10%硫酸调至 pH 5-6(脱钙)。 滤过, 除去硫酸钙沉淀, 滤液浓缩至小体积, 通过强酸性阳离子交换树脂柱。 用水洗去不被交换的残余酸和其它杂质(海人酸因含有胺基, 故可被交换在柱上),继用 5%氢氧化钠水溶液洗脱, 分别收集中性和碱性部分的洗脱液, 至到洗脱液不呈氨基酸反应为止。 碱性洗脱液再通过弱酸性阳离子交换树脂柱, 以除去钠离子。 收集中性洗脱液,与上一次中性洗脱液合并, 浓缩至 300ml, 备用。 取锦纶-活性炭颗粒 600g, 临用前在 100 C 干燥 5 小时, 放冷, 置入烧杯中加水浸泡,并不断搅拌除去气泡, 然后倒入一长 6.7cm、 高 51 cm 的色谱柱中。 将上述浓缩液以每分钟6-7ml 的流速加入到活性炭色谱柱上, 待样品加完后, 用少量蒸馏水洗涤色谱柱顶端的残余样品。然后依次以 5000ml水、6000ml 5%的乙醇水溶液、8000ml 10%的乙醇水溶液、2000ml 20%的乙醇水溶液、 1000ml 50%的乙醇水溶液、 6000ml 70%的乙醇水溶液洗脱。 分部收集,每份 500 ml, 减压浓缩至 15 ml 左右, 用纸色谱检查, 将 Rf值在 0.55 的斑点合并, 减压浓缩至小体积, 即可析出结晶(海人草酸, 得量为 5-13/ 100000, 用水重结晶, 得针状结晶,熔点 243 C)。 NHCOOHCH2COOHCCH2H3C 海人草酸( -kainic acid)

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